qPCR樣所有PCR方法 - 擴(kuò)增核酸，但qPCR也實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)過(guò)程。當(dāng)qPCR工作時(shí)，科學(xué)家必須設(shè)計(jì)和驗(yàn)證測(cè)定。這在該過(guò)程的各個(gè)方面造成各種挑戰(zhàn)。
“Promega（麥迪遜，威斯康星）研究和開(kāi)發(fā)小組的**研究科學(xué)家Rod Pennington說(shuō)：”在設(shè)計(jì)一個(gè)qPCR測(cè)定中心對(duì)選擇引物和探針序列以及報(bào)道染料，尤其是多重測(cè)定中的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。“此外，寡核苷酸序列的選擇和與可用的實(shí)時(shí)qPCR儀器兼容的檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)可能是一種困難的平衡作用。”他補(bǔ)充說(shuō)，“多重測(cè)定中希望檢測(cè)的目標(biāo)越多，平衡作用越不穩(wěn)定可。”
另外的挑戰(zhàn)進(jìn)一步使設(shè)計(jì)階段復(fù)雜化。例如，Thermo Fisher Scientific（Waltham，MA）遺傳分析的**產(chǎn)品經(jīng)理Karen Li指出需要獲得**新的序列信息，避免“序列變異，包括SNP，插入，缺失和低復(fù)雜性序列“。有了這些信息，Li說(shuō)，科學(xué)家然后需要確保”測(cè)定靶向獨(dú)特的序列，并且不會(huì)靶向基因組中的多個(gè)斑點(diǎn)。
靶標(biāo)的特征影響PCR的工作程度。“在查看轉(zhuǎn)錄本時(shí)，**好在外顯子 - 外顯子連接處設(shè)計(jì)分析，以便不會(huì)檢測(cè)目標(biāo)基因組DNA。”Li解釋說(shuō)。“考慮是否需要檢測(cè)一個(gè)特定的轉(zhuǎn)錄本，或者如果你想檢測(cè)同一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄本變異。”她補(bǔ)充說(shuō)，“對(duì)于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，確保你正在查看物種特異性靶點(diǎn)。
qPCR技術(shù)的一些進(jìn)展使得更容易設(shè)計(jì)新的測(cè)定法。“具有多個(gè)檢測(cè)通道的qPCR儀器可以在一定程度上簡(jiǎn)化測(cè)定設(shè)計(jì)，通過(guò)擴(kuò)展設(shè)計(jì)寡核苷酸和探針的選項(xiàng)，”Pennington說(shuō)。“在試劑方面，新的探針化學(xué)物質(zhì)繼續(xù)被引入，并增加了測(cè)定設(shè)計(jì)的靈活性。
科學(xué)家也可以依靠現(xiàn)有的qPCR測(cè)定。如Li所說(shuō)，“我們有廣泛和不斷增長(zhǎng)的預(yù)先設(shè)計(jì)的TaqMan分析的選擇，其跨越一系列應(yīng)用 - 基因表達(dá)，SNP檢測(cè)，拷貝數(shù)分析等，其使用廣泛的生物信息學(xué)分析設(shè)計(jì)，使用**新的序列信息來(lái)自公共數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)測(cè)定設(shè)計(jì)進(jìn)行計(jì)算機(jī)質(zhì)量控制以應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)。
對(duì)于新的qPCR測(cè)定，請(qǐng)考慮使用設(shè)計(jì)工具。正如李先生指出的，“有許多測(cè)定設(shè)計(jì)工具可以幫助定制化驗(yàn)設(shè)計(jì)。”她補(bǔ)充說(shuō)，“我們的定制化驗(yàn)設(shè)計(jì)工具--www.Thermofisher.com/ cadt-具有'定制加'管道選項(xiàng)將執(zhí)行在我們預(yù)設(shè)計(jì)的測(cè)定法上進(jìn)行的相同的生物信息學(xué)分析“。例如，該工具通常設(shè)計(jì)具有較小擴(kuò)增子的分析，以在PCR反應(yīng)中獲得更好的效率，并且為轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)和轉(zhuǎn)錄物特異性靶標(biāo)提供選擇。
一旦科學(xué)家設(shè)計(jì)了一種測(cè)定，還有更多的工作要做，如優(yōu)化它。“qPCR測(cè)定的成功取決于必須優(yōu)化大量變量，例如組分濃度和熱循環(huán)參數(shù)，”Pennington解釋說(shuō)。“qPCR測(cè)定的優(yōu)化矩陣可能非常復(fù)雜，應(yīng)包括代表性樣品材料的測(cè)試。
所需的優(yōu)化級(jí)別取決于設(shè)計(jì)的質(zhì)量。“良好的測(cè)定設(shè)計(jì)對(duì)于**大限度減少優(yōu)化qPCR測(cè)定所需的工作**關(guān)重要，”Li說(shuō)。“如果不注意在均勻的溫度下設(shè)計(jì)引物和探針，優(yōu)化可能會(huì)有挑戰(zhàn)性。”如果設(shè)計(jì)不夠仔細(xì)，則需要更多的工作來(lái)盡可能高效地運(yùn)行測(cè)定。As Li解釋說(shuō)，“如果您不進(jìn)行優(yōu)化您的測(cè)定設(shè)計(jì)的前期工作，您將需要優(yōu)化您的PCR反應(yīng)，以找到**佳的退火/延伸溫度，不僅適用于您的引物和探針，你的主人混合和儀器。
在某些情況下，優(yōu)化可能比在其他情況下更難。Pennington說(shuō)：“如果樣品材料難以獲得，測(cè)定優(yōu)化實(shí)驗(yàn)材料的可用性可能會(huì)有問(wèn)題。
為了在優(yōu)化的**佳結(jié)果，科學(xué)家可能尋求qPCR技術(shù)的具體功能。“具有高通量潛力的儀器可以幫助優(yōu)化，”Pennington說(shuō)。“高通量潛力可能來(lái)自快速熱循環(huán)，容易與機(jī)器人移液站接口或其他功能。”同時(shí)運(yùn)行多個(gè)熱循環(huán)曲線也可加快科學(xué)家優(yōu)化測(cè)定的速度。
試劑也影響優(yōu)化。“新的主混合產(chǎn)品相當(dāng)頻繁地引入，并且在某些情況下允許從優(yōu)化矩陣中去除某些參數(shù)，例如MgCl 2或酶濃度，”Pennington解釋說(shuō)。“這可以減少實(shí)驗(yàn)所需的實(shí)驗(yàn)范圍。
在經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)和優(yōu)化qPCR測(cè)定的步驟后，需要對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，以證明它真正做到了應(yīng)該做的事情。BioNTech Diagnostics（德GMainz）分子診斷科學(xué)家Mark Laible說(shuō)：“從我的角度來(lái)看，qPCR測(cè)定驗(yàn)證中**具挑戰(zhàn)性的部分是由不同qPCR平臺(tái)引入的方差評(píng)估。“注意到您開(kāi)發(fā)的測(cè)定儀器類型容易出現(xiàn)大的儀器間變化，這可能非常令人失望。
為了減少這種問(wèn)題的可能性，他說(shuō)，**好是“在技術(shù)開(kāi)發(fā)早期選擇儀器間差異較小的儀器”。Laible說(shuō)，要做這樣的選擇，應(yīng)該**少“三種不同儀器的特定型號(hào)“。他補(bǔ)充說(shuō)，”大多數(shù)儀器制造商都有助于讓您與其他實(shí)驗(yàn)室接觸。
驗(yàn)證所需的努力通常取決于手頭的應(yīng)用。在許多情況下，市售的測(cè)定法將完成這項(xiàng)工作。然而，當(dāng)需要時(shí)，可以開(kāi)發(fā)用于特定應(yīng)用的全新的qPCR測(cè)定。通過(guò)合適的qPCR和試劑，加上經(jīng)驗(yàn)和設(shè)計(jì)工具，科學(xué)家可以設(shè)計(jì)，優(yōu)化和驗(yàn)證測(cè)定。
